Бм список ниш: 500 ниш от Бизнес

3.1. Клеточная основа сосудистой ниши

Клеточная основа сосудистой ниши неоднородна по своей природе и происхождению: синусоидальные сосуды снабжаются артериолами и капиллярами, которые происходят от развилки артериальных сосудов, охватывающих полость костного мозга [32]. Синусоиды связаны межсинусоидальными капиллярами и в совокупности впадают в центральный синус. В дополнение к предоставлению ниши для самообновления, экспансии и поддержания HSCs, синусоидальные эндотелиальные клетки (SECs) играют роль как в обеспечении платформы для дифференцировки гемопоэтических клеток, так и в канале для мобилизации и возвращения гемопоэтических клеток в и из них. БМ [32, 36].Идея о том, что синусоиды могут представлять пролиферативную нишу, согласуется с недавними исследованиями, указывающими на то, что Е-селектин, молекула адгезии, конститутивно экспрессирующаяся в определенных синусоидальных микродоменах костного мозга, способствует пролиферации ГСК, а блокада Е-селектина защищает ГСК после химиотерапии или -облучения [37]. , 38]. Таким образом, прерывистые SEC составляют функциональную гемопоэтическую сосудистую нишу и играют важную роль в гемопоэтических процессах. Взаимодействуя с ГСК и окружающими их, сосудистая ниша поддерживает ряд гемопоэтических процессов при активации ГСК.

Гистохимический анализ молекулы активации сигнальных лимфоцитов (SLAM) показал, что около 60% SLAM-маркированных ГСК визуализируются вблизи СПК, что указывает на существование альтернативной ниши в сосудистой зоне [8, 39]. Было показано, что после трансплантации КМ ГСК предпочитали вживляться в сосудистые домены КМ у мышей, не получавших никакого другого лечения [40].

3.2. Функция сосудистой ниши

До сих пор было известно, что сосудистая ниша влияет на гемопоэз и поддержание ГСК.Во время кроветворения ГСК мобилизуются из покоящегося состояния [32, 41], мигрируют в кровоток, проникая через стенку синусоидов [35], и, наконец, дифференцируются в несколько видов клеток крови [42]. Как только BM находится в состоянии стресса, в селезенке или печени происходит экстрамедуллярный гемопоэз в сосудистой нише, чтобы дополнить функцию при аномальном BM [43]. В процессе участвуют различные факторы, которые будут обсуждаться ниже.

Кроме того, эндотелиальные клетки также играют важную роль во время кроветворной регенерации, как показали другие исследования.Например, трансплантация эндотелиальных клеток-предшественников ускоряла восстановление синусоидальных сосудов костного мозга после облучения, что коррелировало с более высоким восстановлением клеточности костного мозга и ГСК [44].

В селезенке мышей, мобилизованных циклофосфамидом/Г-КСФ, около 62% ГСК с отчетливым поверхностным маркером CD150 ⁺ CD48 ⁻ CD41 ⁻ наблюдались в контакте с синусоидальными ЭК, в то время как остальные клетки (38%) всегда находились вблизи синусоид [4]. В другом исследовании при тесном контакте с ЭК синусоидов печени происходит экстрамедуллярное печеночное кроветворение, что свидетельствует о том, что печень обеспечивает сходное микроокружение для поддержания и роста кроветворных клеток по сравнению с КМ [8, 45, 46].Все эти данные свидетельствуют о том, что сосудистая ниша может действовать как подкрепление для поддержки поддержания и дифференцировки HSCs, когда BM работает ненормально.

3.3. Взаимодействие с остеобластной нишей

Поскольку синусоидные ЭК действуют как альтернативная ниша для ГСК наряду с остеобластной нишей, было выдвинуто предположение, что сосудистая ниша подвергается дифференцировке ГСК, в то время как остеобластная ниша предлагает спокойное микроокружение [32]. Это можно объяснить тем фактом, что сосудистая ниша по сравнению с остеобластной нишей обеспечивает более богатую питательными веществами микросреду, характеризующуюся более высокими концентрациями кислорода и факторов роста, что приводит к тому, что ГСК являются пролиферативными и зрелыми клетками крови, в конечном итоге высвобождающимися в периферический кровоток [32]. , 41].Следуя этому процессу, другой вероятной функцией этого типа ниш является поддержка HSCs в трансэндотелиальной миграции. Клетки крови могут легко проходить через синусоидальную стенку, поскольку она состоит из одного слоя ЭК [35]. Следовательно, сосудистая ниша может не только способствовать пролиферации и дифференцировке ГСК при гематопоэтическом стрессе [42], но также обеспечивает немедленный выброс ГСК в кровоток.

Как правило, остеобластная ниша может поддерживать ГСК в состоянии покоя [14, 47]; между тем, сосудистая ниша регулирует мобилизацию HSCs.Однако это показало, что ECs, взаимодействующие с HSCs, могут играть необходимую роль в поддержании или пролиферации HSCs in vitro или in vivo . А так как многие HSCs в контакте с BMECs пролиферируют в любой момент времени, вероятно, что HSCs внутри сосудистого костного мозга являются самообновляющимися, а не долговременно бездействующими [8]. Брандт и его коллеги сообщили, что микрососудистые ЭК свиньи (PMVEC) могут опосредовать экспансию человеческих HSC ex vivo , а HSC, выделенные из совместной культуры PMVEC, были способны к репопуляции в BM мышей SCID [48]. In vivo гемопоэз хозяина может быть восстановлен у летально облученных мышей после трансплантации ЭК, выделенных из головного мозга или легких, что указывает на важную роль ЭК в самообновлении и репарации HSC [33]. Инфузии аллогенных эндотелиальных клеток-предшественников вызывали восстановление кроветворения и увеличение LT-HSCs у мышей с миелосупрессией, индуцированной облучением всего тела (TBI-), что позволяет предположить, что ECs положительно регулируют регенерацию HSC in vivo [44].

Кроме того, сообщалось, что гемопоэтические клетки могут происходить из ЭК. На раннем этапе развития наряду с васкуляризацией происходит кроветворение, и эндотелий отвечает за появление ГСК в области аорта-гонад-мезонефрос (АГМ) in vivo [49]. Кроме того, во многих исследованиях было показано, что некоторые клетки гемопоэтических кластеров, находящихся на дне дорсальной части аорты у видов от амфибий до человека, плотно контактируют с ЭК в нарушенной области просвета [49–51].Впоследствии с помощью экспериментов по отслеживанию клонов как у мышей, так и у рыбок данио стало ясно, что гемогенный эндотелий в вентральной части дорсальной аорты является первоначальным источником HSCs [52-56]. Таким образом, эти элегантные данные указывают на то, что активность большинства HSCs тесно связана с ECs, а эндотелий в AGM является первоначальным источником HSCs. Затем ГСК из АГМ дифференцируются в печени плода и, наконец, оседают во взрослой КМ [52, 57]. Таким образом, эндотелий работает как фабрика, сохраняя способность продуцировать ГСК на ранних стадиях развития организма.Вполне возможно, что эндотелий, выделенный из AGM, может вылечить гематологическое заболевание без присутствия имплантированных HSC.

4. Молекулярная основа для сосудистой ниши, регулирующей гемопоэз

Гематопоэз, регулируемый сосудистой нишей, относится к функциям, которые обсуждались выше, включая подвижность, трансэндотелиальную миграцию, гемопоэтическую дифференцировку и поддержание ГСК внутри или вне костного мозга. Также включен соответствующий компонент, окружающий HSC.Таким образом, остро стоит вопрос: через какой механизм или молекулярную основу этот тип ниши связывает ГСК и их окружение, чтобы поддерживать в порядке его регулярную работу по кроветворению? Молекулы, регулирующие гематопоэз, были обобщены в таблице 1.

4.1. Стромальный клеточный фактор-1 (SDF-1)

Было установлено, что стромальный клеточный фактор-1 (SDF-1), экспрессируемый ЭК КМ, может стимулировать ГСК и ЭК КМ, что приводит к усилению трансэндотелиальной стромальную миграцию за счет активации молекул адгезии [58, 59]. Процесс, при котором SDF-1 индуцирует трансэндотелиальную миграцию, может зависеть от иммобилизованной фракции хемокинов, связанной с компонентами внеклеточного матрикса (ECM) и стромальными клетками костного мозга, называемой «гаптотактическим градиентом» [60, 61].Как правило, покоящиеся HSC, застрявшие в нише остеобластов, должны быть сначала мобилизованы, если необходим гемопоэз. Имеются данные, показывающие, что SDF-1, экспрессируемый остеобластами, помогает HSC возвращаться в нишу остеобластов [62]. Однако экспрессия SDF-1 на ECs предвосхищает ключевую процедуру мобилизации HSCs.

Действительно, несколько сообщений указывают на то, что SDF-1 играет решающую роль в поддержании функции HSC, включая удержание в костном мозге, состояние покоя и репопуляционную активность.Однако также хорошо известно, что в костном мозге SDF-1 в основном экспрессируется тремя популяциями периваскулярных стромальных клеток: ретикулярными клетками с избытком SDF-1, нестин-стромальными клетками и стромальными клетками, содержащими рецептор лептина. Хотя эндотелиальные клетки костного мозга также экспрессируют SDF-1, делеция SDF-1 в клетках специфической ниши указывает на то, что эндотелиальные клетки вносят лишь незначительный вклад, а мезенхимальные предшественники являются основным источником SDF-1, который поддерживает HSCs. В соответствии с представлением о том, что множественные составляющие ниши выполняют разные функции, условная делеция Cxcl12 с помощью Lepr-credos не влияет на количество HSC в костном мозге, но индуцирует их мобилизацию [63].

In vitro , в присутствии SDF-1, экспрессируемого BMECs, фрагментация мегакариоцитов увеличивается, когда CXCR-4- (SDF-1 рецептор-) положительные мегакариоциты мигрируют через слой BMECs, предполагая, что контакт между мегакариоцитов и BMEC важен для тромбопоэза in vitro [36, 64]. Таким образом, SDF-1 способен повышать сродство и миграционную способность мегакариоцитов через BMEC. Кроме того, было показано, что эндотелиальный FGF- (фактор роста фибробластов-) 4 поддерживает адгезию мегакариоцитов к BMEC.Сообщалось, что SDF-1 и FGF-4 индуцируют экспрессию молекул адгезии, в том числе очень поздний антиген- (VLA-) 4, экспрессируемый мегакариоцитами, и VCAM-1, экспрессируемый BMEC [34, 65]. Аналогичным образом, антитело CXCR-4 останавливает восстановление тромбоцитоза после лечения 5-ФУ у мышей c-Mpl ^-/- и приводит к уменьшению мегакариоцитов, а также истощению сосудистой ниши [36], что демонстрирует, что SDF-1 играет роль ключевую роль в дифференцировке ГСК. Более того, SDF-1 может способствовать сосудисто-зависимому тромбопоэзу у мышей с дефицитом тромбопоэтина (ТПО) [36].Поскольку ЭК также маркируются SDF-1, возможность того, что механизм ЭК, направляющий самообновление HSCs, имеет отношение к SDF-1, остается, однако молекулярный подход находится в стадии изучения.

На основании механизма действия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) было высказано предположение, что градиентный сдвиг различных типов SDF-1 может вызывать мобилизацию ГСК. Мобилизация может быть усилена SDF-1 на ECs, способствуя проникновению гемопоэтических предшественников в эндотелий, что приводит к дифференцировке.Так, мобилизация, индуцированная G-CSF, сопровождается постепенным снижением остеобластического SDF-1 и повышением экспрессии CXCR- (endothelial SDF-1 рецептор-) 4 на ГСК [66]. По сходному механизму экспрессия Tie2 (эндотелиального рецептора ангиопоэтина-1 и ангиопоэтина-2) снижается в сосудистой нише костного мозга во время стационарного гемопоэза. HSC также маркируются Tie2, который обеспечивает адгезию HSC к остеобластам, регулируя состояние покоя в остеобластной нише [14]. И ингибирование передачи сигналов Tie2 на ECs приводило к нарушению восстановления сосудистой ниши, а также к замедлению восстановления гемопоэза [67].Таким образом, Tie2 что-то делает с поддержанием HSCs, а подавление Tie2 с помощью G-CSF направляет подвижность HSCs [14].

4.2. Notch Signaling

Более того, недавнее исследование показало, что ECs, заставляющие долговременные HSCs подвергаться потенциалу самообновления, имеют большое отношение к передаче сигналов Notch [68]. Эндотелиальные клетки экспрессируют лиганды Notch Jagged, которые поддерживают долговременную пролиферацию HSC и предотвращают их истощение. Экспрессия Notch в HSCs зависит от передачи сигналов Wnt и необходима для поддержания недифференцированного состояния [69].При использовании трансгенных мышей-репортеров Notch (TNR.GFP ⁺ ), у которых сигнальный путь Notch (экспрессируемый на ЭК) стимулирует экспрессию GFP, было подтверждено, что ЭК поддерживают долгосрочную экспансию TNR.Gfp ⁺ cKit ⁺ . Sca-1 ⁺ Lineage ⁻ (TNR.Gfp ⁺ KLS), но не Notch2 ^−/− Notch3 ^−/− CD34 ⁻ Flt-3 ⁻ KLS Кроме того, активация ангиогенной экспрессии notch-лигандов смещает баланс между экспансией и клон-специфичной дифференцировкой долгосрочных HSCs в сторону экспансии LT-HSCs, замедляя дифференцировку [68].Т.о., внутри сосудистой ниши высвобождение экспрессирующих ангиокрин лигандов notch с помощью ECs функционирует, чтобы установить инструктивную нишу для восстановления пула LT-HSC [45].

5. Сосудистые ЭК-секретирующие факторы, опосредующие самообновление и регенерацию ГСК

Выше упоминалось, что сосудистая ниша обладает способностью помогать ГСК самообновлению и репопуляции в КМ, в которых процессы ЭК играют решающую роль [33, 44]. Т.о., передача сигналов BM EC жизненно важна для восстановления кроветворения in vivo .Химбург и др. и Кобаяши и др. предположили, что растворимые факторы, продуцируемые ЭК BM, могут быть ответственны за самообновление и регенерацию HSC in vivo , но детальные механизмы остаются неизвестными [63, 70]. Механизм действия нескольких факторов будет рассмотрен ниже.

5.1. Фактор стволовых клеток (SCF)

Предполагается, что фактор стволовых клеток (SCF) экспрессируется эндотелиальными клетками, фибробластами костного мозга, остеобластами, периваскулярными стромальными клетками, экспрессирующими CXCL12, и мезенхимальными стволовыми клетками, экспрессирующими нестин [71, 72].Недавно сообщалось, что у мышей с делецией SCF, экспрессируемого на эндотелиальных клетках (Tie2-cre;), наблюдается снижение частоты LT-HSC с уменьшенной способностью к репопуляции во время трансплантации конгенного костного мозга. Делеция SCF в гемопоэтических клетках, остеобластах или клетках Nestin ⁺ не изменяет функции HSC, что идентифицирует SCF как специфическую молекулу in vivo, полученную из BM EC, которая регулирует HSC [1].

5.2. Эндотелиальные селектины (E-селектин)

Эндотелиальные селектины (E-селектин) представляют собой молекулы клеточной адгезии, которые экспрессируются в сосудистых нишах HSC, к которым прикрепляются гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники [37].Недавние исследования показали, что молекула адгезии Е-селектин экспрессируется исключительно эндотелиальными клетками костного мозга в сосудистой нише. У мышей с нокаутом E-селектина (Sele ^-/- ) было усилено состояние покоя HSC, а потенциал самообновления увеличился. При введении антагониста E-селектина результаты показали, что E-селектин способствует пролиферации HSC и является важным компонентом сосудистой ниши [37].

5.3. Гликопротеин 130 (gp130)

Гликопротеин 130 (gp130), сигнальная субъединица, общая для семейства рецепторов интерлейкина-6 (IL-6) цитокинов, также вносит значительный вклад в гемопоэз.Делеция gp130 в гематопоэтических и ЭК мышей с помощью рекомбинации генов, опосредованной Cre/ loxP , вызывала дисфункцию костного мозга, приводящую к тяжелой анемии во взрослом возрасте. Нормальный гемопоэз восстанавливался при трансплантации gp130-дефицитного BM облученным мышам дикого типа, тогда как гемопоэтические дефекты все еще существовали при трансплантации BM дикого типа облученным gp130-дефицитным мышам. Этот результат показал, что экспрессия gp130 на ECs, а не на самих гемопоэтических клетках, оказывает большое влияние на гемопоэз, предоставляя доказательства того, что ECs зависят от передачи сигналов gp130 для поддержки кроветворения, реагируя на сигналы от цитокинов семейства IL-6 [73].

5.4. Плейотрофин (PTN)

Недавно было показано, что гепарин-связывающий фактор роста, плейотрофин (PTN), секретируемый ЭК КМ, вызывает регенерацию ГСК у мышей после облучения всего тела высокой дозой (ЧМТ). Эти эффекты можно объяснить связыванием и ингибированием белкового рецептора тирозинфосфатазы-зета (PTPRz) на ГСК КМ [70].

6. Заключение

Сосудистая ниша играет ключевую роль в поддержании гемопоэза, включая подвижность, трансэндотелиальную миграцию и гемопоэтическую дифференцировку.Более того, по сравнению с длительно спящими ГСК в остеобластной нише, сосудистая ниша поддерживает самообновление ГСК, что приводит к поддержанию ГСК. Таким образом, сосудистая ниша может регулировать гемопоэз и поддерживать самообновление HSCs. Таким образом, воссоздание этой ниши в организме с нарушением кроветворения может заменить терапевтический метод трансплантации ГСК. Эндотелиальные терапевтические методы прольют свет на заболевания кроветворения, такие как апластическая анемия и лейкемия, ускорят восстановление кроветворения после химиотерапии или сократят время реконструкции кроветворения после трансплантации костного мозга.Хотя было показано, что механистические пути, такие как передача сигналов Notch и CXCR-4-SDF-1, способствуют эндостальной и ретикулярной клеточной регуляции HSCs судьбы in vivo , механизмы, с помощью которых сосудистая ниша регулирует поддержание и регенерацию HSCs, остаются менее четко определенными. . И выяснение механистических взаимодействий и корегуляции кроветворения остеобластами, ECs и другими клетками микроокружения BM будет центральной задачей ближайшего десятилетия. Дальнейшие исследования продвинут существующие результаты вперед и сделают большой прорыв в сосудистой нише.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в связи с публикацией данной статьи.

Вклад авторов

Ниннин Хэ и Лу Чжан внесли равный вклад в настоящую работу.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальной ключевой научной программой Китая (2011CB964903), Национальным фондом естественных наук Китая (81371620), Тяньцзиньским фондом естественных наук (12JCZDJC24900) и Программой для выдающихся талантов нового века в университете (NCET). Государственное министерство образования Китая (NCET-12-0282).

Старая ниша костного мозга сдерживает омоложенные гемопоэтические стволовые клетки — Guidi — 2021 — СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

1 ВВЕДЕНИЕ

Старые гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) способствуют развитию лейкемии, связанной со старением, и ремоделированию иммунной системы, связанному со старением. ^{1, 2} Старение приводит к увеличению количества ГСК в костном мозге (КМ), в то время как старые ГСК демонстрируют сниженный потенциал восстановления, миелоидную асимметрию, измененные профили экспрессии генов и эпигенетические модификации ^3-7 и переключение от асимметричных до симметричных отделов. ^8-10 При старении также отмечается увеличение частоты ГСК с неполярным распределением белков полярности. ^{11, 12} Старение HSC может даже повлиять на продолжительность жизни. ¹³ Механизмы, присущие HSC, а также внешние сигналы (ниша/микроокружение) могут вызывать старение HSC. ^{14, 15} Например, снижение связанной со старением повышенной активности малой RhoGTPase Cdc42 в старых HSC ex vivo с помощью специфического ингибитора активности Cdc42 CASIN ¹⁶ приводит к омоложению функции старых HSC.Эта юношеская функция старых омоложенных ГСК сохраняется при их трансплантации молодым реципиентам. ^{2, 9, 17}

Молодые HSCs при трансплантации в старую нишу BM демонстрируют признаки старых HSCs. ^{18, 19} Это указывает на сильное влияние стареющей ниши на функцию ГСК. В соответствии с этой концепцией мы недавно продемонстрировали, что снижение уровня секретируемого цитокина остеопонтина (ОПН) в нише старого костного мозга придает признаки старения молодым ГСК, ¹⁹ , подобно увеличению размера пула ГСК (см. также Справку). 20), снижение частоты ГСК, полярных для белков полярности, и увеличение потенциала миелоидной дифференцировки ГСК. ¹⁹ Экспрессия OPN в BM ограничена эндостальной поверхностью кости. ²¹ Интересно, что секретируемый OPN в конечном итоге передает сигналы через интегрины α9β1 на HSC, чтобы регулировать активность Cdc42 и, таким образом, полярность HSC. ^{19, 22} Влияние ниши (молодые или старые) на омоложенные старые ГСК, следовательно, является критическим вопросом для разработки подходов к замедлению старения ГСК in vivo. Таким образом, целью этого исследования было определить, может ли старая ниша влиять на молодоподобную функцию омоложенных старых HSC.

2 МЕТОДЫ

2.1 Мыши

молодых мышей C57BL/6 (возраст 8-10 недель, Janvier, St. Berthevin Cedex, Франция). Старые мыши C57BL/6 (19-24 месяца) и мыши с нокаутом OPN (KO) (C57BL/6, 8-12 недель) были получены из внутреннего поголовья. C57BL/6.SJL- Ptprc ^a /Boy (BoyJ) молодых (8-10 недель) и старых (19-24 месяцев) мышей получали из Charles River Laboratories, Зульцфельд, Германия, или из внутренних склад.

2.2 Конкурентная трансплантация ДТ-ГСК

Двести старых LT-HSC (Ly5.1 ⁺ ) культивировали в течение 16 часов в HBSS + 10% FBS с 5 мкМ CASIN или без него при 37°C, 5% CO ₂ , 3% O ₂ и трансплантировали вместе с 3 × 10 ⁵ клеток BM от молодых мышей C57BL/6 (Ly5.2 ⁺ ) в молодых, старых и молодых мышей-реципиентов OPN KO C57BL/6 (Ly5.2 ⁺ ). Донорский химеризм в крови и костном мозге анализировали до 23 недель после трансплантации.Для экспериментов, показанных на дополнительном рисунке 1, 200 молодых или старых LT-HSC (Ly5.1 ⁺ ) культивировали в течение 16 часов в HBSS + 10% FBS с 5 мкМ CASIN или без него при 37 °C, 5% CO ₂ , 3% O ₂ и трансплантированы вместе с 3 × 10 ⁵ клетками костного мозга молодых мышей C57BL/6 (Ly5.2 ⁺ ) реципиенту C57BL/6 молодых (молодых в молодых) или старых (старых в старых) реципиентов мыши (Ly5.2 ⁺ ).

2.3 Проточная цитометрия и сортировка клеток

Иммуноокрашивание периферической крови (PB) и клеток костного мозга выполняли в соответствии со стандартными процедурами и анализировали на проточном цитометре LSRII или BD FACSAria III (BD BioSciences, Гейдельберг, Германия).Антитела: анти-Ly5.2 (клон 104), анти-Ly5.1 (клон А20), анти-CD3e (клон 145-2С11), анти-В220 (клон RA3-6B2), анти-Mac-1 (клон М1 /70) и анти-Gr-1 (клон RC57BL/6-8C5), анти-CD11b (клон M1/70), анти-B220 (клон RA3-6B2), анти-CD5 (клон 53-7.3), анти- Gr-1 (клон RB6-8C5), анти-Ter119 и анти-CD8a (клон 53-6.7). После истощения линии с помощью магнитной сепарации (Dynabeads, Invitrogen, Dreieich, Германия) клетки окрашивали анти-Sca-1 (клон D7), анти-c-Kit (клон 2B8), анти-CD34 (клон RAM34), анти-CD127. (клон A7R34), анти-CD16/CD32 (клон 2.4G2) (BD Biosciences, Гейдельберг, Германия), анти-Flk-2 (клон A2F10) и стрептавидин. Все антитела были получены от eBioscience (Dreieich, Германия), если не указано иное. Данные анализа FACS (стволовые клетки и клетки-предшественники) были нанесены на график в процентах от долгосрочных гемопоэтических стволовых клеток (LT-HSCs, гейтированных как LSK CD34 ^-/low Flk2 ^— ), краткосрочных гемопоэтических стволовых клеток (ST- HSCs, гейтированные как LSK CD34 ⁺ Flk2 ⁻ ), и мультипотентные предшественники (MPPs, гейтированные как LSK CD34 ⁺ Flk2 ⁺ ) среди донорских LSK (Lin ^neg c-kit) sca-1 ⁺ клеток).Обычные миелоидные предшественники (CMPS, закрыты как Lin ^NEG C-Kit ⁺ CD34 ⁺ CD16 / 32 ^— ), MegakaryoCyte-эритроциты (MEPS Gated как Lin ^Neg C-Kit ⁺ CD34 ⁻ CD16/32 ⁻ ) и гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (GMPs, закрытые как Lin ^neg c-kit ⁺ CD34 ⁺ CD16/32 ⁺ ). Данные анализа FACS (дифференцированные клетки) представлены в виде процента В-клеток (B220+), Т-клеток (CD3+) и миелоидных (Gr-1+, Mac-1+ и Gr-1+Mac-1+) клеток среди донорский Ly5.1 + ячейки.

2.4 Иммунофлуоресцентное окрашивание

LT-HSC высевали на покровные стекла, покрытые фибронектином, инкубировали в течение 16 часов в HBSS, 10% FBS, 37°C, 5% CO ₂ , 3% O ₂ , с 5 мкМ CASIN, фиксировали 4% PFA. , промывали PBS, пермеабилизировали 0,2% Triton X-100 (Sigma, Дармштадт, Германия) в PBS в течение 20 минут и блокировали 10% ослиной сывороткой (Sigma, Дармштадт, Германия) в течение 30 минут. Антитело к α-тубулину (Abcam, Берлин, Германия, крысиное моноклональное ab6160), антитело к крысиному DyLight488, конъюгированное с DyLight488 (Jackson ImmunoResearch, Гамбург, Германия) и анти-h5K16ac (07-329) от Millipore, Дармштадт, Германия, анти- — кроличьи антитела, конъюгированные с DyLight549 (Jackson ImmunoResearch, Гамбург, Германия), в течение 1 часа при комнатной температуре.Предметные стекла наносили на реагент ProLong Gold Antifade с DAPI (Invitrogen, Molecular Probes, Dreieich, Германия), визуализировали на AxioObserver Z1 (Zeiss, Оберкохен, Германия) и анализировали с помощью программного обеспечения AxioVision 4.6.

2.5 Статистический анализ

Однофакторный дисперсионный анализ или двухфакторный дисперсионный анализ использовались для сравнения средних значений среди трех или более независимых групп. Последующий тест Бонферрони для сравнения всех пар набора данных был определен, когда общее значение P было <.05. Все статистические анализы проводились с помощью Prism версии 8.0.1.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В предыдущих экспериментах молодые или старые Ly5.2 HSC трансплантировали молодым реципиентам Ly5.1. Аллель Ly5.1 у конгенных животных Ly5.1 содержит помимо Ly5.1 другие гены, которые могут влиять на кроветворение. ²³ Новые эксперименты, в которых молодые Ly5.1+ HSC трансплантировали молодым Ly5.2+ реципиентам, а старые Ly5.1+ HSC трансплантировали старым Ly5.Реципиенты 2+ подтвердили «возрастную функцию» также старых Ly5.1+ HSCs при трансплантации старым Ly5.2+ реципиентам (дополнительная фигура 1), аналогично тому, что сообщалось ранее для старых Ly5.2 HSCs, трансплантированных молодым Ly5.1+ получатели. ^{17, 24} Приживление донорских клеток было (как и ожидалось) высоким в трансплантатах Ly5.1+ Y→Ly5.2+ Y (молодые в молодые, Y→Y) и низким в Ly5.1+ O→Ly5.2+ A (от старых к старым, O➔A) трансплантатам с более низким вкладом старых Ly5.1+ HSC в B- и T-клетки в PB (дополнительная фигура 1B, C).Мы также наблюдали более высокий вклад старых HSC в частоту миелоидных клеток в PB и в частоту LT-HSC и ST-HSC в BM (дополнительная фигура 1D-F). Кроме того, частота MPP в BM была снижена в O➔A по сравнению с трансплантатами Y➔Y (дополнительная фигура 1G), тогда как частоты CMP, GMP и MEP были одинаковыми в обеих экспериментальных группах (дополнительная фигура 1H-J) и таким образом, не подвержены старению. Недавно мы описали сниженную частоту HSCs, полярных для распределения тубулина, как новый признак среди старых HSCs.HSC от пожилых реципиентов, которым трансплантировали старые Ly5.1+ HSC, также показали низкую частоту HSC, полярных для тубулина (дополнительная фигура 1K, L). Конгенный интервал, который окружает локус Ly5.1, таким образом, не по-разному влияет на связанные со старением изменения фенотипов и функции старых Ly5.1+ HSCs по сравнению со старыми Ly5.2+ HSCs. Результат этих критических контрольных экспериментов позволил провести сравнительный анализ функции старых Ly5.1+ HSC в различных типах ниш в следующих экспериментах по трансплантации.

Для определения того, в какой степени возраст ниши влияет на молодоподобную функцию и полярность омоложенных ex vivo старых HSC, старых или старых HSC (Ly5.1+), подвергшихся воздействию ингибитора активности Cdc42 CASIN (омоложенные старые HSC ⁹ ) были трансплантированы вместе с клетками-конкурентами Ly5.2+ BM молодым (как опубликовано ранее ⁹ ) или в этих наборах экспериментов теперь также реципиентам в возрасте (рис. 1A). У старых мышей уровень цитокина OPN сильно снижен в резидентных остеобластах BM, тогда как молодая ниша, в которой отсутствует OPN, превращает молодые HSC в функционально старые в отношении фенотипов и функции HSC.Таким образом, ^{19, 25} Старые HSC и омоложенные старые HSC также трансплантировали реципиентам OPN KO, чтобы проверить, влияет ли отсутствие OPN в нише на функцию старых омоложенных HSC (рис. 1A). Донорский химеризм в крови и костном мозге анализировали до 23 недель после трансплантации.

Возрастная микросреда сдерживает CASIN-зависимое омоложение старых гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). А, схематическое изображение экспериментальной установки: (Ly5.1+) 200 клеток HSC от старых доноров обрабатывали +/- CASIN в течение 16 часов ex vivo, а затем конкурентно трансплантировали либо молодому (Y), старому (A), либо молодому (OPN) реципиенту с нокаутом остеопонтина (KO) (Ly5. 2+) мыши. B, частота вклада старых доноров (клетки Ly5.1+) +/- CASIN в общее количество лейкоцитов в периферической крови (PB) молодых, старых и молодых мышей-реципиентов OPN KO (Ly5.2+). C, Частота старых В-клеток +/- CASIN. D, старые Т-клетки +/- CASIN. E, старые миелоидные клетки +/- CASIN среди донорских клеток Ly5.1+ в PB молодых, старых и молодых реципиентов OPN KO (Ly5.2+) мыши. F, частота старых LT-HSC +/- CASIN в костном мозге (BM) среди донорских клеток Ly5.1+ LSK у молодых, старых и молодых мышей-реципиентов OPN KO (Ly5.2+). Данные основаны на пяти экспериментальных повторах с тремя мышами-реципиентами на группу (например, n = 11-15 на группу). G, Частота встречаемости старых LT-HSC +/- CASIN донорского происхождения, поляризованных по тубулину, отобранных из разных экспериментальных групп (Ly5.2+) мышей через 23 недели после трансплантации. п = 5; ~ 40 клеток на образец в каждой экспериментальной повторности.H, репрезентативное распределение тубулина (зеленый) в старых донорских LT-HSC +/- CASIN (клетки Ly5.1+), отобранных из разных экспериментальных групп через 23 недели после трансплантации. Масштабная линейка = 6 мкм. Показаны средние значения + 1 SEM. * P  < .05, *** P  < .001

Уровень химеризма, поддерживаемый старыми или старыми омоложенными ГСК при трансплантации молодым, пожилым или реципиентам ОПН КО, был одинаковым для каждого типа донорских ГСК, за исключением старых ГСК, трансплантированных молодым реципиентам.В этих условиях, как уже сообщалось в ¹⁹ , старые HSC показали значительно более высокий химеризм по сравнению со старыми HSC, трансплантированными старым реципиентам. Не было дифференциального химеризма среди молодых, старых реципиентов или реципиентов OPN KO, которым трансплантировали старые омоложенные (обработанные CASIN) HSC (рис. 1B).

B-клеток у реципиентов, которым были введены старые или старые омоложенные HSC, была одинаковой у молодых, старых или реципиентов OPN KO (рис. 1C). Частота Т-клеток, полученных из старых омоложенных ГСК, была увеличена по сравнению с частотой у молодых реципиентов, которым трансплантировали старые ГСК.Эта частота была снижена у пожилых реципиентов или реципиентов OPN KO (рис. 1D). Это показывает, что юношеская частота Т-клеток (см. также дополнительную фигуру 1C), поддерживаемая старыми омоложенными HSC, на самом деле требует молодой ниши, и это не зависит от возраста тимуса (см. также ссылку 2) и что отсутствие OPN в ниши было достаточно, чтобы нарушить частоту Т-клеток, поддерживаемую старыми омоложенными HSC. Частота донорских миелоидных клеток (в % от донорского химеризма) была низкой у молодых реципиентов, которым трансплантировали старые омоложенные ГСК (рис. 1Е и ссылка 17).Старые омоложенные HSC при трансплантации старым или молодым реципиентам OPN KO снова поддерживали высокий уровень миелоидных клеток, аналогичный уровню, обнаруживаемому у молодых реципиентов, которым трансплантировали старые HSC (рис. 1E). Следовательно, старая ниша также оказывает сильное регулирующее влияние на уровень миелоидных клеток на периферии, независимо от возраста ГСК, аналогично тому, что мы наблюдали для Т-клеток.

Молодые реципиенты, получившие старые омоложенные HSC, показали низкую частоту LT-HSCs в пределах BM ¹⁷ (рис. 1F).У старых животных или животных с нокаутом OPN при трансплантации старых омоложенных HSC наблюдалась лишь слегка повышенная частота LT-HSC (рис. 1F). Старые HSC являются аполярными для распределения тубулина или маркера эпигенетической полярности h5K16ac, тогда как молодые или старые омоложенные HSC при трансплантации молодым реципиентам остаются более полярными для распределения тубулина или h5K16ac ^{17, 19} (рис. 1G,H). . Старые омоложенные HSC при трансплантации пожилым реципиентам показали низкую частоту клеток, поляризованных для тубулина, которая была аналогична таковой у старых HSC (рис. 1G, H; дополнительный рисунок 1K, L).Интересно, что HSC от реципиентов OPN KO, которым трансплантировали старые омоложенные HSC, имели частоту HSC, полярную для распределения тубулина, которая была более похожа на частоту, обнаруженную у молодых реципиентов (рис. 1G, H). Напротив, HSC от пожилых реципиентов, которым трансплантировали старые омоложенные HSC, показали частоту клеток, поляризованных по маркеру эпигенетической полярности h5K16ac, аналогичную частоте, обнаруживаемой у молодых реципиентов или реципиентов OPN KO (дополнительная фигура 1M). Эти результаты подразумевают, что хотя возрастная ниша влияет на уровень полярности тубулина, но не на полярность h5K16ac, этот эффект может быть не просто следствием низкого уровня OPN, как это наблюдается для дифференцировки Т-клеток (рис. 1D).

Старение приводит к снижению частоты MPP в BM, но не влияет на частоту CMP, GMP и MEP ^{17, 24} (дополнительный рисунок 1G-J). Мы наблюдали небольшое, но значительное увеличение частоты ST-HSCs у молодых реципиентов, которым вводили старые омоложенные HSC, по сравнению с молодыми реципиентами, которым вводили старые HSC (рис. 2A). Интересно, что на частоту MPP не влияло ни омоложение HSC, ни тип животного-реципиента (рис. 2B), ни какой-либо из перечисленных выше других типов клеток-предшественников в BM (дополнительный рисунок 1N-P).

Старая микросреда не повреждает мультипотентные клетки-предшественники, происходящие из старых омоложенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). A, частота ST-HSC и B, частота мультипотентных предшественников (MPP) среди донорских клеток Ly5.1+ LSK в костном мозге (BM) молодых, старых и молодых реципиентов с нокаутом остеопонтина (OPN) (KO) ( Ly5.2+) мышей. C, Young-подобные фенотипы омоложенных старых HSCs, ослабленных стареющей нишей. Показаны средние значения + 1 SEM.* P  < .05

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши данные демонстрируют, что устойчивая юношеская функция омоложенных старых HSC при трансплантации молодым реципиентам является, по крайней мере, частично комбинацией внутреннего и внешнего вклада стволовых клеток (ниша/микроокружение). Некоторые из признаков старения HSC, которые возвращаются в юношеское состояние, когда омоложенные старые HSC трансплантируют молодым мышам, возвращаются к старому фенотипу, когда омоложенные старые HSC находятся в состарившейся нише (рис. 2C).Для некоторых фенотипов это может быть связано со сниженным уровнем OPN в возрастных нишах. Таким образом, влияние ниши на омоложенные HSCs необходимо учитывать для подходов, направленных на омоложение старых HSCs in vivo.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Cores в Ульмском университете и CCHMC за поддержку сортировки клеток и Tierforschungszentrum Университета Ульма за поддержку нашей работы с животными. Работа с животными была одобрена Regierungspräsidium Tübingen.Эта работа была поддержана грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1279) Х. Гейгеру. Мы благодарим Люси Лио за любезный подарок нокаутных мышей OPN. Финансирование открытого доступа разрешено и организовано Projekt DEAL.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявили об отсутствии потенциального конфликта интересов.

АВТОРСКИЕ ВКЛАДЫ

NG: концепция и дизайн, сбор и сбор данных, анализ и интерпретация данных, написание рукописи, окончательное утверждение рукописи; Г.М., В.С.: сбор данных; Ю.З.: интерпретация данных; M.C.F.: концепция и дизайн, интерпретация данных; HG: концепция и дизайн, финансовая поддержка, административная поддержка, предоставление учебного материала, интерпретация данных, написание рукописи, окончательное утверждение рукописи.

Молекулярный переключатель костномозгового происхождения между остеогенезом и кроветворением

1. Марта Галан-Диез и
2. Ставрула Куштень
1. Кафедра физиологии и клеточной биофизики, Колледж врачей и хирургов, Колумбийский университет, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10032, США
1. Автор, ответственный за переписку: sk2836{at}cumc.columbia.edu

Аннотация

Гематопоэтические стволовые клетки (ГСК) находятся и поддерживаются в специализированных микросредах костного мозга, известных как ниши, состоящие из различных типов клеток. Среди них лептиновый рецептор (LepR), экспрессирующий хемокиновый лиганд CXC 12 (CXCL12), обильный Известно, что ретикулярные (CAR) клетки создают нишу для ГСК и в то же время дают начало остеобластам.Эти две функции клеток CAR/LepR ⁺ , по-видимому, строго, но обратно регулируются, чтобы обеспечить адекватное физическое пространство для HSC. Однако как остеогенез предотвращается в клетках CAR, чтобы сохранить пространство, доступное для HSCs, и гемопоэз остается неясным. В этом выпуске Genes & Development Сейке и его коллеги (стр. 359–372) сообщают, что транскрипционный фактор раннего В-клеточного фактора ( Ebf3 ) преимущественно экспрессируется клетками CAR/LepR ⁺ и ингибирует клетки CAR. дифференцировку в остеобласты с одновременным сохранением самообновления клеток CAR/LepR ⁺ .Используя условно нокаутные и ретровирусные системы, исследователи показали, что потеря Ebf3 в клетках CAR снижает количество HSC и приводит к остеосклерозу. Это исследование дает новое понимание требований к транскрипции. для формирования кости CAR-клетками путем идентификации Ebf3 как нишевого фактора, секретируемого клетками CAR/Lepr ⁺ , который регулирует взаимодействие между остеогенезом и гемопоэзом.

Одной из важнейших и уникальных функций скелета является обеспечение анатомических пространств для поддержания кроветворения.Костный мозг является основным местом пребывания гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), где они самообновляются, пролиферируют или становятся постепенно ограничивается несколькими зафиксированными предшественниками и/или отдельными линиями, дающими начало различным типам зрелых кровяные клетки. В костном мозге ГСК динамически взаимодействуют со сложной сетью стромальных клеток. Такие группы клеток представляют собой совокупность нескольких специализированных «микрониш», которые поддерживают кроветворение, влияя на различные функции HSC, такие как самонаведение, мобилизация, покой, самообновление или приверженность родословной.Поучительные подсказки предоставляются как необходимые аутокринные, эндокринные и паракринные сигналы, а также прямые межклеточные взаимодействия между стромальными нишами и HSCs.

Многочисленные исследования изучали роль линии остеобластов в ГСК и указывают на то, что регуляция остеобластов гемопоэза зависит от стадии дифференцировки остеобластов (Sacchetti et al. 2007; Wu et al. 2008; Méndez-Ferrer et al.2010 г.; Кальви и др. 2012 г.; Кунисаки и др. 2013). В то время как наиболее незрелая подгруппа некоммитированных предшественников влияет на поддержание и пролиферацию HSC, коммитированные предшественники или зрелые остеобласты приспосабливают дифференцировку HSC вдоль лимфоидных, миелоидных и эритроидных линий (Calvi et al. 2003; Zhu et al. 2007; Ding and Morrison 2013; Krevvata et al. 2014). В самом деле, самообновляющиеся остеопредшественники клеток в костном мозге могут образовывать поддерживающие ниши HSC (Sacchetti et al. 2007). Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) эндостальной ниши в непосредственной близости от ГСК экспрессируют секретируемые молекулы или молекулы клеточной поверхности. которые регулируют состояние покоя HSC (Nilsson et al.2005 г.; Зильберштейн и др. 2016). Нестин-позитивные МСК продуцируют растворимые факторы, участвующие в поддержании ГСК, такие как хемокиновый лиганд 12 СХС (CXCL12) и фактор стволовых клеток (SCF) и колокализуются с HSCs, а их истощение приводит к мобилизации HSC (Méndez-Ferrer et al. 2010). Эти наблюдения показали, что остеогенез и поддержание HSC в костном мозге могут быть обратно пропорциональны.

Периваскулярные ниши регулируют поддержание и покой HSC.Артериолярная ниша, отмеченная редкими NG2 (CSPG4 ⁺ ) перицитами, ингибирует цикличность HSC и снижает функциональные долгосрочные репопуляции HSC в костном мозге (Kunisaki et al. 2013). Отдельная перисинусоидная ниша, содержащая большинство делящихся и неделящихся HSC, по-видимому, регулирует взаимодействие. между остеогенезом и кроветворением. Клетки в перисинусоидной нише, которые экспрессируют высокие уровни CXCL12 и SCF (CXCL12-богатые ретикулярные [CAR] клетки) составляют большинство периваскулярных клеток (Omatsu et al.2010) и перекрываются с перисинусоидальными клетками, идентифицированными на основании их экспрессии рецептора лептина (LepR) (Zhou et al. 2014). CAR и CAR/LepR ⁺ МСК, составляющие ~0,3% клеток костного мозга, включают почти все фибробласты, образующие колонии (КОЕ-Ф), являются основным источником адипоцитов и остеобластов в костном мозге взрослых мышей и необходимы для поддержки поддержания HSC. Тем не мение, большинство клеток CAR/LepR ⁺ могут оставаться недифференцированными в полости костного мозга, и остается неясным, как предотвращается остеогенез в большинстве случаев. CAR/LepR ⁺ клеток для поддержания пространства, доступного для HSCs и гемопоэза.

Чтобы ответить на этот вопрос, Seike et al. (2018) стремились идентифицировать регуляторы транскрипции клеток CAR и сосредоточились на факторах транскрипции раннего В-клеточного фактора. (Эбф) семья. Они обнаружили, что Ebf3 преимущественно экспрессируется в клетках CAR по сравнению с эндотелиальными, гемопоэтическими и стромальными клетками взрослого костного мозга. Отслеживание линии клеток Ebf3 , экспрессирующих CAR/LepR ⁺ , проводили с использованием тройных мутантов мышей, экспрессирующих CreERT2 , нокаутированных в эндогенном локусе Ebf3 , трансгене Cxcl12-GFP и Cre-активированных мышах, экспрессирующих CreERT2 Помидор (tdTomato).Количество Ebf3 -экспрессирующих CAR-клеток, дающих начало адипоцитам и остеобластам в костном мозге, оставалось стабильным в течение курса лечения. 13 мес., предполагая, что они способны к самообновлению. Условная делеция Ebf3 в клетках CAR/LepR ⁺ или во всех МСК развивающихся конечностей приводила к уменьшению числа долговременно репопулирующих ГСК (ДТ-ГСК), мегакариоцитов/эритроцитов. предшественники (MEP) проэритробласты, общие лимфоидные предшественники (CLP) и предшественники гранулоцитов/макрофагов (GMP).Кроме того, у старых мышей количество функциональных ГСК уменьшалось. Этот скомпрометированный гемопоэтический фенотип коррелирует с повышенным количества остеобластов и остеогенеза и более низкой экспрессии Cxcl12 и Scf в клетках CAR/LepR ⁺ . В результате у старых мышей развился остеосклероз. Интересно, что остаточный бета-положительный рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFRβ ⁺ ) Sca-1 ^— CD31 ^— CD45 ^— и Ter119 ^— CAR клетки имели гораздо более высокие уровни экспрессии маркеров остеобластов.В совокупности эти результаты показали, что кроветворная нишевая функция стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC) клеток CAR была серьезно нарушена, и что большинство клеток CAR было более дифференцировались в линию остеобластов в отсутствие Ebf3 .

Чтобы лишить клетки CAR всех экспрессированных изоформ Ebf , исследователи инактивировали как Ebf3 , так и Ebf1 в МСК, включая клетки CAR.В возрасте 1 недели в костном мозге образовались полости, а количество CAR-клеток не изменилось. нормальная морфология с длинными отростками; однако у них была увеличена экспрессия маркеров остеобластов Osterix , Col1a1 и Osteocalcin и снижена экспрессия Cxcl12 и Scf по сравнению с контрольными животными. Это свидетельствует о том, что большинство клеток CAR более дифференцированы в остеобласты. линии у мутантных животных.Общее количество гемопоэтических клеток и количество LT-HSC, MEP, проэритробластов, CLP и GMP. действительно были снижены у мутантов. К 26-недельному возрасту у мышей с двойным нокаутом наблюдалась окклюзия полости костного мозга и снижение Сотовый номер автомобиля. Следовательно, Ebf1/Ebf3 , по-видимому, не определяют судьбу клеток CAR во время эмбриогенеза, но необходимы для ингибирования дифференцировки клеток CAR в линия остеобластов для поддержания пространств костного мозга.

Чтобы изучить соответствующие вклады Ebf3 и Ebf1 в поддержание HSC и дифференцировку остеобластов, исследователи изучали скелетные и гемопоэтические фенотипы взрослых CAR/LepR ⁺ клеточно-специфические Ebf1 ^-/- ;Ebf3 ^+/- и Ebf1 + 5 ; Ebf3 ^-/- мышей.Серьезная редукция предшественников ГСК в костном мозге приводила к экстрамедуллярному кроветворению и заметному увеличению в трабекулярной костной массе. Это было связано с увеличением числа остеобластов без изменений в остеокластах, что наблюдалось в Ebf1 ^-/+ ; Ebf3 ^-/- мышей, но не у Ebf1 ^-/- ;Ebf3 ^+/- мышей в возрасте 34 недель. клетки CAR из CAR/LepR ⁺ клеточно-специфические Ebf1 ^-/+ ; Ebf3 ^-/- мышей, но не Ebf1 ^-/- ;Ebf3 ^+/- мышей, имели более высокую экспрессию маркеров остеобластов.Следовательно, активности одного функционального аллеля Ebf3 достаточно для поддержания костномозговых пространств и ГСК и подавления остеобластогенеза, тогда как одного аллеля Ebf1 недостаточно. Наконец, сверхэкспрессия Ebf1 и Ebf3 в отсортированных CAR-клетках увеличивала экспрессию Cxcl12 и Scf и снижала их остеогенный потенциал в культуре. Этот эффект зависел от ДНК-связывающего домена Ebf3 .

В заключение, это исследование идентифицирует Ebf3 как молекулярный триггер, который действует как клеточно-автономным, так и клеточно-неавтономным образом в клетках CAR/LepR ⁺ , подавляя их дифференцировку в линию остеобластов, чтобы поддерживать их HSC-поддерживающая функция (рис.1). Точные характеристики клеток остеолинии, ответственных за поддержку ГСК, представляют большой интерес, поскольку они могут можно использовать для прогнозирования того, могут ли терапевтические стратегии, регулирующие коммитацию остеобластов, также использоваться для усиления образование ниш ГСК из ненишевых клеток.

Рисунок 1. Клетки

CAR/LepR ⁺ представляют собой МСК, окружающие синусоиды и/или вблизи эндоста.Они экспрессируют высокие уровни хемокина Cxcl12, ключевого HSC. фактор ниши, который вместе с Scf регулирует содержание и удержание ГСК в нише костного мозга. остеогенный и Потенциал адипогенной дифференцировки клеток CAR/LepR ⁺ ингибируется экспрессией факторов транскрипции Ebf1/3 , гарантируя, что эти специализированные МСК остаются недифференцированными, и позволяя поддерживать полость костного мозга, контролируя экспрессию Cxcl12 и Scf как хорошо физически сохраняя нишу HSC.

Биомиметическая инженерия in vitro гемопоэтической ниши человека с функциональными свойствами

Микроокружение костного мозга (КМ) отвечает за поддержание активности гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), что позволяет производить зрелые клетки крови на протяжении всей жизни (1, 2). Регуляция самообновления и дифференцировки ГСК достигается сложными клеточными (3), молекулярными (4, 5), структурными (6) и физическими (7, 8) сигналами, определяющими нишу ГСК (2, 9).Компоненты ниши HSC человека и то, как эти элементы взаимодействуют, чтобы модулировать судьбу стволовых клеток, остаются плохо изученными.

Поле затруднено из-за ограниченных возможностей доступа и использования информации от человеческих особей. Химерные животные модели (10) наиболее точно воспроизводят физиологию человека in vivo, но в этих условиях эта ниша остается недоступной для экспериментальных манипуляций и оптических наблюдений (11, 12). Кроме того, межвидовой химеризм как в гемопоэтических клетках, так и в их окружении затрудняет интерпретацию экспериментальных результатов.Разработка заменителей in vitro является многообещающей альтернативой с превосходной настраиваемостью и производительностью (13, 14). Предыдущие исследования описывали комбинацию различных стромальных и гемопоэтических предшественников с использованием различных культуральных субстратов (9⇓–11), что приводило к фенотипическому сохранению специфических фенотипов крови. Тем не менее, повторение структурной организации BM, включая основные межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия (15⇓⇓⇓–19), и связанное с этим функциональное сохранение HSCs (20) все еще неуловимы.

Потребность в передовых культуральных системах более высокой биологической сложности получает все большее признание (21) для изучения фундаментальной биологии стволовых клеток. Подобно «органогенезу в чашке», предложенному для сложных органов [например, легких (22), молочной железы (23), почек (24) и печени (25)], инженерия in vitro среды БМ человека (21, 26 ⇓–28), способные поддерживать ГСК (28, 29), позволят их изучать в условиях, свободных от ксеногенов.

Здесь мы сообщаем о системе in vitro, поддерживающей разработку и обслуживание аналога BM человека.Наш подход заключается в использовании пористых гидроксиапатитовых каркасов со структурными и композиционными особенностями кости (30), функционализированных мезенхимальными стромальными клетками человека (hMSC) и внеклеточным матриксом (ECM), депонированным во время их постепенного созревания в остеобластную линию. Культивирование hMSC проводят при прямом перфузионном потоке (31), обеспечивая эффективное снабжение питательными веществами/удалением отходов, имитируя интерстициальный поток и связанное с ним напряжение сдвига. Кровяной компартмент вводили в полученную трехмерную стромальную ткань путем перфузии клеток CD34 ⁺ , полученных из очищенной пуповинной крови человека (CB).Этот сконструированный органоид частично повторяет структурные и функциональные особенности человеческого BM в определенных и настраиваемых условиях.

Results

Трехмерные микроокружения могут быть созданы внутри системы перфузионного биореактора.

Создание трехмерных микроокружений было выполнено путем дифференцировки первичных hMSC, полученных из костного мозга, на керамических материалах в перфузионном биореакторе. Клетки сначала метили трансгеном VENUS (>93%) ( SI Приложение , рис.S1 A ) для облегчения последующего анализа. Чтобы добиться инженерии остеобластоподобной стромы, мы приняли протокол, ранее использовавшийся для создания костных трансплантатов (32) (рис. 1 A ). hMSC сначала культивировали в течение 1 недели в пролиферативной среде (PM) для увеличения числа клеток и обеспечения колонизации каркаса, а затем в течение 3 недель добавляли остеогенную среду (OM) для стимулирования дифференцировки клеток при одновременной стимуляции продукции внеклеточного матрикса (ECM) (33). Полученная ткань была определена как «инженерная ниша» (eN) (рис.1 A ), в то время как голая керамика (Ce) (рис. 1 A ), не содержащая hMSC, но загруженная клетками CD34 ⁺ , использовалась в качестве внутреннего контроля 3D-культуры. Кровяной отсек впоследствии вводили путем инъекции клеток CD34 ⁺ человека, полученных из CB, от отдельных доноров в трубку устройства. Совместное культивирование in vitro поддерживали в течение 1 недели в бессывороточной среде с добавлением низких концентраций гемопоэтических цитокинов [10 нг/мл тромбопоэтина (ТПО), фактора стволовых клеток (SCF) и лиганда тирозинкиназы 3, родственного Fms (Flt3- л)].После извлечения из камеры биореактора Ce не имел очевидных структур ECM (Ce, SI, Приложение , рис. S1 B ), в то время как eN демонстрировал черты инженерной ткани с толстыми гелеобразными структурами, гомогенно покрывающими исходный материал. (eN, рис. 1 B ). Сканирующая электронная микроскопия подтвердила отложение внеклеточного матрикса, в котором заключены клетки, предположительно как стромального (фибробластическая форма, рис. 1 B ), так и кровяного происхождения (круглая форма, рис. 1 B ), включая делящиеся клетки (рис.1 В ).

Рис. 1.

В системе перфузионного биореактора можно создавать трехмерные микроокружения. ( A ) Экспериментальный дизайн для создания трехмерных ниш в перфузионном биореакторе. ОМ — остеогенная среда; ПМ — пролиферативная среда; SFEM+GF, бессывороточная среда плюс факторы роста, фактор стволовых клеток, тромбопоэтин и лиганд Flt3. ( B ) Сконструированная ниша (eN, Left ) демонстрирует плотные гелеобразные структуры, гомогенно покрывающие исходный материал (Ce).Сканирующая электронная микроскопия изображений eN ( Right ) подтвердила отложение внеклеточного матрикса, который включает клетки, предположительно как стромального, так и кровяного происхождения. Стрелки указывают на наличие делящихся клеток.

Созданные трехмерные микроокружения позволяют поддерживать гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники с функциональными свойствами.

Чтобы охарактеризовать их клеточный состав, 3D-микросреда была обработана для извлечения клеток (эффективность извлечения> 92%, с общей гибелью клеток ниже 1.5%) ( SI Приложение , рис. S1 B и C ) и последующий количественный фенотипический анализ ( SI Приложение , рис. S1 D и E ).

eN состоял из более чем 4,7 × 10 ⁶ клеток крови ( SI Приложение , рис. S1 F ) на биореакторную систему [61-кратное увеличение (fi) по сравнению с исходными 70 000 CD34 ⁺ клеток] ( Приложение SI , рис. S1 G ). Напротив, в отсутствие инженерной стромы размножение клеток крови было ограничено до 7.8 ф.и. ( SI Приложение , рис. S1 F и G ). Было показано, что при соотношении HSPCs над коммитированными клетками (CD34 ^— /CD38 ⁺ ) ниже, чем Ce (38 против 204) ( SI Приложение , рис. S1 H ), eN, как было показано, поддерживает распространение дифференцированных популяций. ЭН также способствовал поддержанию фенотипических гематопоэтических стволовых популяций и популяций предшественников (HSPCs) (рис. 2 A ), приводя к систематически более высокому общему количеству HSPCs (46.2 ф.и. против 6,4 для Ce), включая HSC (13,8 fi против 1,6), мультипотентные предшественники (MPP) (8,5 fi против 2,3) и мультипотентные лимфоидные предшественники (MLP) (161 fi против 20) ( SI Приложение , Рис. S2 A ).

Рис. 2.

Спроектированные трехмерные микроокружения позволяют поддерживать HSPC с функциональными свойствами. ( A ) Сконструированная ниша (eN) поддерживает экспансию фенотипических гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC), гемопоэтических стволовых клеток (HSC), мультипотентных клеток-предшественников (MPP) и мультипотентных лимфоидных клеток-предшественников (MLP), согласно количественной оценке анализ проточной цитометрии после 3D-культуры. n ≥ 8 биологических повторов. Ce, только керамика. *** Р < 0,001, **** Р < 0,0001. ( B ) Улучшенное поддержание колониеобразующего потенциала eN по сравнению с клетками CD34 ⁺ , культивируемыми Ce. BFU-E, взрывообразующая единица-эритроид; GEmM, колониеобразующая единица-гранулоцит, эритроид, макрофаг, мегакариоцит; ГМ, колониеобразующие единицы-гранулоциты и макрофаги. n ≥ 9 биологических повторов. ( C ) Долгосрочная репопуляционная способность eN и Ce культивируемых клеток CD34 ⁺ .Восстановление компартмента крови человека (процент клеток CD45 человека ⁺ в мононуклеарных клетках) у мышей NSG показано с помощью анализа периферической крови проточной цитометрией. Положительным контролем служили некультивируемые клетки CD34 ⁺ . n ≥ 4 биологических повторов. Клетки CD34 ⁺ человека, культивированные на eN и Ce, также прочно прижились в костном мозге и селезенке ( D ) трансплантированных мышей, что оценивалось с помощью проточной цитометрии через 28 недель после трансплантации. n ≥ 4 биологических повторов.

Способность hMSC поддерживать пролиферацию клеток CD34 ⁺ была дополнительно подтверждена в 2D-установке ( SI Приложение , рис. S2 B ). Используя недифференцированные hMSC в качестве фидерного слоя (2D hMSC) по сравнению с контролем без hMSC (2D), мы наблюдали значительное увеличение фенотипических HSPC (100 fi против 15), HSC (29 fi против 4), MPP (43 fi против 16) и MLP (279 fi против 21) ( SI Приложение , рис. S2 B ), в соответствии с результатами, полученными на хорошо зарекомендовавших себя культурах Dexter (34, 35).Способность образованной стромы сохранять функциональность культивируемых клеток крови оценивали как с помощью анализов in vitro, так и in vivo. Соответствующие донорские клетки до культивирования in vitro («некультивируемые») использовали в качестве функционального положительного контроля. Анализы колониеобразующих единиц in vitro продемонстрировали сохранение способности стволовых клеток или клеток-предшественников (с многолинейностью и потенциалом пролиферации) культивируемых клеток CD34 ⁺ , на что указывает образование миелоидных колоний с той же морфологией, что и их некультивируемые аналоги (приложение SI). , рис.S2 С ). Количество колоний было увеличено для клеток, извлеченных из 3D-культур, для колониеобразующих единиц-гранулоцитов и макрофагов (GM) (42,8 fi против 4,8 для Ce), взрывообразующих единиц-эритроидов (BFU-E) (113 fi против 18). , и колониеобразующая единица-гранулоциты (GEmM) (36,5 мкм против 4,8) колоний (рис. 2 B ).

Стволовой и прогениторный потенциал культивируемых клеток дополнительно тестировали путем внутрибедренной трансплантации равного количества клеток CD34 ⁺ из Ce или eN облученным мышам NSG.Кровяной компартмент человека был успешно восстановлен во всех группах [>1% CD45-положительных клеток человека (hCD45) в периферической крови] (Фиг. 2 C ). Химеризм был обнаружен уже на 6-й неделе и сохранялся в течение 28 недель после трансплантации, что указывает на долгосрочную способность трансплантированных клеток к репопуляции. Как и ожидалось, самый высокий химеризм был получен при трансплантации некультивируемых CD34 ⁺ , служащих положительным контролем (27,9 ± 3,1%) (фиг. 2 C ). Клетки CD34 ⁺ , полученные из Ce и eN, демонстрировали аналогичные уровни восстановления, в среднем 2.7 ± 0,8% и 6,4 ± 1% hCD45 соответственно, обнаруженные в периферической крови (рис. 2 C ). Химеризм также оценивали в БМ и селезенке животных с прочно привитыми клетками человека во всех условиях, с тенденцией к более высокой частоте hCD45, обнаруженной в eN, чем в группе Се, как в БМ (6,4% ± 0,5 против 5,2 % ± 2,5, рис. 2 D ) и селезенки (12,6 % ± 4,4 против 5,6 % ± 2,8, рис. 2 D ). Функциональность клеток CD34 ⁺ дополнительно оценивали по способности к реконституции мультиклонов.На 18-й неделе после трансплантации клетки из всех состояний успешно восстанавливали миелоидные и лимфоидные линии ( SI, Приложение , рис. S2 D ).

Эти данные показывают, что, по сравнению с аналогами Ce, eN дает гемопоэтические клетки с аналогичным потенциалом восстановления, но в большем количестве. Это говорит о том, что генерируемая ткань обеспечивает сигналы, способные усиливать поддержание/экспансию CFU-HSPC с потенциалом приживления трансплантата in vivo и восстановления нескольких линий.

Молекулярная характеристика спроектированной ниши показывает создание остеобластоподобной трехмерной среды.

Для выявления факторов, связанных с устойчивым развитием кроветворения, была дополнительно охарактеризована eN. Во-первых, мы отслеживали секрецию ключевых цитокинов на протяжении всего времени культивирования. Воспалительные факторы [интерлейкин 6 (IL-6), интерлейкин 8 (IL-8), макрофагальный колониестимулирующий фактор (MCSF) (рис. 3 A ) и моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (MCP-1)] показали самые высокие различия и были обнаружены при высоких концентрациях в eN.В частности, продукция IL-6 и IL-8 существенно увеличивалась при добавлении HSPC (eN, фиг. 3, —). Белки Flt3-L, TPO и SCF были обнаружены в концентрациях, сходных с концентрациями, добавленными в среду совместного культивирования ( SI, Приложение , рис. S3 A ), что позволяет предположить, что hMSC секретируют низкие уровни этих поддерживающих HSPC факторов. Фактор роста эндотелия сосудов α (VEGFα) и ангиопоэтин 1 (Ang-1) также были обнаружены на значительных уровнях (eN, SI, Приложение , рис.S3 A ), хотя Ang-1 со временем снижался и оставался стабильным после загрузки HSPC.

Рис. 3.

Молекулярная характеристика спроектированной ниши показывает создание остеобластоподобной трехмерной среды. ( A ) В условиях искусственной ниши (eN) наблюдается более высокая концентрация воспалительных цитокинов, чем в керамическом состоянии (Ce), согласно анализу Luminex супернатантов 3D-культуры. ИЛ-6, интерлейкин 6; ИЛ-8, интерлейкин 8; MCP-1, моноцитарный хемотаксический белок 1; MCSF, колониестимулирующий фактор макрофагов. n ≥ 3 биологических повторов. Добавление клеток CD34 ⁺ в ниши индуцирует секрецию цитокинов только в условиях eN. ( B ) hMSCs несут основную ответственность за высокие уровни воспалительных цитокинов, обнаруженных в eN. Это было оценено с помощью анализа экспрессии генов клеток-предшественников крови (CD34 ⁺ ) и hMSC до (28-й день) и после совместного культивирования с клетками крови (35-й день). n ≥ 3 биологических повторов. ( C ) hMSCs приобретают генетический профиль остеобластоподобной ниши в культуре.Анализ экспрессии генов hMSC, полученных из eN (eN hMSC). hMSC (hMSC день 0) указывают основные уровни экспрессии генов до их 3D-культуры. ALP, щелочная фосфатаза; BSP, костный сиалопротеин; HIF1α, индуцируемый гипоксией фактор 1α. n ≥ 3 биологических повторов.

Чтобы получить более полное представление о клеточных компартментах, связанных с секрецией фактора, мы изолировали как кровяные предшественники (CD34 ⁺ ), так и мезенхимальные популяции до (определяется как hMSC на 28 день) ( SI Приложение , рис.S3 B ) и после кокультуры CD34 ⁺ (определяется как eN-hMSC 35 день, Приложение SI , рис. S3 B ). Это подтвердило сильную экспрессию воспалительных цитокинов (IL-6, MCSF) hMSC во время совместного культивирования с HSPC с уровнями, заметно более высокими, чем в клетках-предшественниках крови (Fig. 3 B ). IL-8 и MCP-1 экспрессировались как клетками крови, так и мезенхимальными клетками (фиг. 3 B ). Интересно, что после совместного культивирования с клетками CD34 ⁺ hMSC значительно увеличили экспрессию IL-6 и IL-8 (фиг.3 В ).

Чтобы оценить роль IL-6 и IL-8 в системе, мы исследовали эффект их добавления в условиях Ce ( SI Приложение , рис. S4 A ). IL-6 и IL-8 в дозах, соответствующих измеренным в eN, приводили к значительному увеличению числа HSPC, коммитированных предшественников (CD34 ⁺ /CD38 ⁺ ), гранулоцитарно-моноцитарных предшественников (GMP) и MLP ( Приложение SI , рис. S4 B ). Однако никакого влияния на HSC и MPP не наблюдалось ( SI, Приложение , рис.С4 Б ). Это предполагает, что эти воспалительные цитокины опосредуют пролиферацию коммитированных популяций в eN, тогда как наблюдаемое расширение компартмента стволовых клеток управляется другими факторами hMSC.

До загрузки CD34 ⁺ hMSC в сконструированной ткани преимущественно состояли не только из остеобластоподобных клеток, но также из пула, экспрессирующего маркеры-предшественники ( SI Приложение , рис. S5). Далее мы проанализировали профиль транскрипции eN-hMSC как нишевых клеток в конце культивирования (eN-hMSC, день 35) и сравнили его с hMSC после экспансии (hMSC, день 0) и hMSC в eN до загрузки CD34 ⁺ (hMSC день 28).Это подтвердило остеобластический профиль hMSC (35-й день) в конце 3D-культивирования, о чем свидетельствует активация щелочной фосфатазы (ALP) и костного сиалопротеина (BSP) (17 и 869 мкФ соответственно) (рис. 3 ). С ). Интересно, что заметное увеличение экспрессии Nestin (117 мкФ) было получено hMSC после совместного культивирования с клетками крови (рис. 3 C ), а также снижение индуцируемого гипоксией фактора 1-альфа (HIF1α, 8,9-кратное) выражение.

Таким образом, комбинируя анализ экспрессии белка и гена, мы описываем остеобластную (36, 37) и связанную с нишей (1) молекулярную подпись чМСК, связанную с провоспалительными свойствами, которая приобретается после кокультуры с кровяным компартментом.Это указывает на создание остеобластоподобной нишевой среды, взаимодействующей с гемопоэтическими клетками и способной регулировать активность HSPC, включая пролиферацию и функциональную регуляцию.

Спроектированная ниша имеет общие структурные и композиционные особенности с родным человеческим БМ.

Роль hMSC в создании благоприятной среды для гемопоэтического компартмента была дополнительно исследована путем изучения организации и состава eN.Иммунофлуоресцентный анализ срезов толстой конструкции выявил однородную сеть, образованную hMSCs внутри каркаса (сигнал VENUS, рис. 4 A ). Эта наблюдаемая мезенхимальная фракция состояла из 1,3 × 10 ⁶ клеток, происходящих из hMSC (рис. 4 B ), по оценке проточной цитометрии. Генерируемая ткань, полученная в результате остеобластной дифференцировки hMSC, состояла из плотной стромы человека, заполняющей поры материала и включающей мезенхимальные клетки (рис. 4 C ).В состав депонированного ВКМ входят коллаген типа 1, коллаген типа 4 и фибронектин (рис. 4 C ), указанные как основные структурные белки костного мозга (38). Действительно, они также были в изобилии обнаружены в образцах BM, полученных от здоровых доноров (человеческая ниша, Fig. 4 D ). Сходство между человеческой тканью и созданной нами нишей не ограничивалось структурными белками. В биоптатах человека окрашивание остеокальцином выявило присутствие остеобластов, выстилающих поверхность кости (рис.4 Д ). Примечательно, что в eN аналогичная картина наблюдалась при обнаружении остеокальцина в клетках на границе между керамическим материалом и стромой клетки/ECM (рис. 4 C ).

Рис. 4.

Сконструированная ниша имеет общие структурные и композиционные особенности с нативным БМ человека. ( A ) hMSCs образуют гомогенную клеточную сеть, распределенную внутри каркасного материала (конфокальная микроскопия, показаны репрезентативные изображения). ( B ) eN состоит из 1.3 × 106 клеток, происходящих из чМСК, в конце 3D-культуры (количественная оценка проточной цитометрией). n = 9 биологических повторов. Композиционное и структурное сходство внеклеточного матрикса в сконструированных нишах ( C ) и образцах костного мозга человека ( D ), оцененное с помощью конфокальной микроскопии. б — костная ткань (автофлуоресценция в синем канале). Стрелки указывают на присутствие остеокальцина в остеобластах, выстилающих поверхность кости.

В целом эти результаты свидетельствуют об успешном формировании сложной ткани при перфузионной культуре, связанной с развитием и поддержкой кроветворения человека (рис.2). Было показано, что сконструированная среда имеет общие структурные и композиционные особенности, типичные для нативного BM человека, что свидетельствует о частичном восстановлении нишевой среды, подобной остеобластам.

Созданная с помощью биореактора ниша показывает функциональную компартментализацию.

Разработанная культуральная система состоит из двух отдельных фаз: жидкой фракции, состоящей из супернатанта (SN) Приложение SI , рис. S6) и стромальной/ECM ткани, заключенной в камеру каркаса (ECM, Приложение SI , Инжир.С6). Это привело нас к дальнейшей гипотезе о том, что две среды могут по-разному влиять на распределение фенотипов клеток крови. Таким образом, мы отдельно проанализировали HSPC, полученные из этих двух фаз, с помощью проточной цитометрии ( SI, Приложение , рис. S6).

Несмотря на конвекцию, вызванную перфузионным потоком, наблюдалось специфическое распределение клеток, поскольку 80% извлеченных популяций HSPC (CD34 ⁺ /CD38 ^— ) находились в ВКМ (рис. 5 A , Left ).Напротив, более совершенные популяции (CD34 ^— / CD38 ⁺ ) демонстрировали сбалансированное распределение с 54% в ECM и 46% в SN (рис. 5 A , справа ). Отличительный паттерн может быть идентифицирован путем дальнейшей оценки предпочтительной локализации популяций стебля и предшественников в соответствии с их прогрессивной детерминацией (Fig. 5 B ). Примечательно, что HSC были обнаружены почти исключительно в строме (98%) (рис. 5 B ) вместе с подавляющим большинством MPP (76% в ECM) (рис.5 В ). Это относилось в меньшей степени к общим миелоидным предшественникам (CMP) и мегакариоцитарно-эритроидным предшественникам (MEP) (67% в ECM), в то время как GMP были более распространены в SN (61%) (рис. 5 B ). Также было показано, что локализация влияет на функциональность клеток in vitro, поскольку клетки CD34 ⁺ , извлеченные из внеклеточного матрикса, проявляли повышенную способность образовывать миелоидные колонии по сравнению с их аналогами SN (рис. 5 C ). Это включает превосходное формирование колоний GEmM, GM и BFU (2.6, 3.7 и 3.1 л.и. соответственно).

Рис. 5.

Ниша, спроектированная биореактором, демонстрирует функциональную компартментализацию. ( A ) В биореакторной системе большинство HSPC локализовано в ткани (ECM), в то время как коммитированные клетки более равномерно распределены между ECM и супернатантом (SN). n ≥ 8 биологических повторов. ( B ) Популяции HSC, MPP и CMP/MEP преимущественно локализуются в строме (ECM), а не в жидкой фазе. n ≥ 8 биологических повторов.( C ) Потенциал формирования верхних миелоидных колоний клеток CD34 ⁺ , извлеченных из внеклеточного матрикса. BFU, взрывообразующая единица-эритроид; GEmM, колониеобразующая единица-гранулоцит, эритроид, макрофаг, мегакариоцит; ГМ, колониеобразующие единицы-гранулоциты и макрофаги. n ≥ 12 биологических повторов. ( D ) Конфокальный микроскопический анализ eN демонстрирует присутствие клеток CD34 ⁺ на разной глубине ткани ( справа , увеличение).Фракции CD34 ⁺ и hMSC были обнаружены внутри организованного внеклеточного матрикса ( E , слева ), в котором они установили физические взаимодействия ( E , справа ). Се, керамика; Col1, коллаген типа 1.

Присутствие клеток крови человека в нише было подтверждено с помощью иммунофлуоресценции, при этом человеческие клетки CD34 ⁺ в большом количестве обнаруживались в ЕСМ сконструированной ткани (рис. 5 D ). Клетки располагались преимущественно по периферии скаффолдов (край, рис.5 D ), но также в значительной степени инфильтрировали ткани, о чем свидетельствует присутствие во внутренних порах (внутренние, рис. 5 D ) и в более центральной области (центральные, рис. 5 D ). Важно отметить, что мезенхимальная и гемопоэтическая фракции в сконструированной строме были обнаружены внутри организованного ВКМ (рис. 5 E , слева ) и тесно взаимодействовали, о чем свидетельствуют явные физические контакты (рис. 5 E , справа ). ).

В целом это демонстрирует существование функционального разделения в трехмерной системе перфузии.eN демонстрирует свойство иерархического хемоаттрактанта в популяциях HSPC, в то время как детерминация постепенно ассоциируется с высвобождением в жидкую фазу. Преимущественное удержание стволовых клеток в строме вместе с доказательствами взаимодействий hMSC-CD34 ⁺ предполагает важную, запускаемую hMSC регуляцию активности HSPC, что приводит к превосходному сохранению функциональности стволовых клеток.

Ниши BM с индивидуальными молекулярными сигнатурами могут быть созданы с помощью генной инженерии.

Затем мы стремились доказать принцип использования нашей системы для создания индивидуальных гемопоэтических ниш с индивидуальной молекулярной сигнатурой.

С этой целью первичные hMSCs эффективно трансдуцировали с использованием лентивируса VENUS-SDF1α (>95%) ( SI Приложение , рис. S7 A и B ), что привело к сверхэкспрессии SDF1α ( SI Приложение , Рис. S7 C ). Затем были получены сконструированные SDF1α ниши (eN-SDF1α) в соответствии с ранее описанным протоколом и проведено сравнение с eN без обогащения SDF1α.На протяжении всего периода культивирования eN-SDF1α непрерывно продуцировал значительные уровни белка SDF1α (>2000 пг/мл/день/биореактор) (рис. 6 A ) по сравнению с eN (<300 пг/мл/день/биореактор). биореактор) (рис. 6 A ).

Рис. 6.

Ниши костного мозга с индивидуальными молекулярными сигнатурами могут быть созданы с помощью генной инженерии. ( A ) Ниша, сконструированная с помощью SDF1α (eN-SDF1α, красные треугольники), секретирует более высокие уровни SDF1α, чем контрольная сконструированная ниша (eN, черные крестики) на протяжении всего периода 3D-культивирования. n ≥ 3 биологических повторов. ( B ) eN и eN-SDF1α оказались макроскопически идентичными ( слева ), но изображения конфокальной микроскопии выявили повышенное присутствие белка SDF1α в ткани eN-SDF1α. ( C ) Сравнение отношения абсолютного количества гемопоэтических популяций из eN и eN-SDF1α выявило идентичное содержание супернатанта (SN, , левый ), в то время как строма eN-SDF1α (ECM, , правый ) содержала уменьшенный количество HSPC, HSC и MPP. n ≥ 8. ( D ) Индивидуализация SDF1α значительно увеличивала процент покоящихся HSPC, HSCs и MPPs в ECM eN-SDF1α, что оценивалось анализом клеточного цикла соответствующих популяций. n = 5. ГСК – гемопоэтические стволовые клетки; HSPCs, гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники; MLP, мультилимфоидные предшественники; MPPs, мультипотентные предшественники. * Р < 0,05.

При извлечении из камер биореактора различные искусственные ткани были макроскопически идентичными (рис.6 В ). Иммунофлуоресцентный анализ выявил присутствие hMSC в обеих нишах, но eN-SDF1α продемонстрировал повышенное присутствие белка SDF1α, подтверждая ранее наблюдаемый характер секреции и подтверждая молекулярную настройку ниши. Белка было особенно много внутриклеточно внутри hMSC, непосредственно выстилающих поверхность керамики (eN-SDF1α, рис. 6 B и SI, Приложение , рис. S7 D ).

Количественный фенотипический анализ методом проточной цитометрии был проведен для оценки эффекта обогащения SDF1α в системе.Общее количество клеток крови, собранных из обоих компартментов (ECM и SN), было одинаковым в группах eN и eN-SDF1α ( SI, Приложение , рис. S8 A ). Однако заметное снижение количества HSPC наблюдалось в eN-SDF1α, что отражалось в значительном кратном увеличении HSC (1,9 fi) и MPP (1,4 fi) в системах eN по сравнению с eN-SDF1α. Важно отметить, что эффект SDF1α, по-видимому, ограничивается этими популяциями, поскольку MLP и общее содержание крови были одинаковыми в обеих нишах ( SI Приложение , рис.S8 А ). Интересно, что наблюдаемые различия коррелировали с компартментализацией системы. Действительно, клеточное содержание как eN, так и eN-SDF1α в SN было идентичным по составу (SN, Fig. 6 C ). Вместо этого в компартменте ECM eN было обнаружено большее количество HSPC, включая более высокое содержание в HSC и MPP (2,1 и 1,6 fi соответственно), в то время как, опять же, MLP и глобальные показатели крови не были затронуты.

Мы исследовали статус клеточного цикла популяций HSPC, HSC и MPP, извлеченных из наших трехмерных условий.Это выявило эффект индукции покоя SDF1α в eN-SDF1α со значительным увеличением HSPC, MPP и HSC в фазе G0 (рис. 6 D и SI Приложение , рис. S8 B и C). ). В частности, в клетках, извлеченных из ECM, мы измерили увеличение на 29,6%, 36,1% и 26,9% количества покоящихся HSPC, HSC и MPP соответственно (рис. 6 D ). Таким образом, наблюдаемые более низкие доли HSC и MPP в ECM ниш eN-SDF1α были обусловлены индукцией покоя сверхэкспрессией SDF1α.

Эти выводы иллюстрируют возможность использования описанной модели для разработки настраиваемых ниш BM, способных конкретно влиять на распределение и поведение HSC и MPP в системе.

Возмущение поведения HSC при моделировании травмы в спроектированной нише.

Далее мы оценили, может ли распределение клеток крови быть нарушено путем имитации повреждения ниши ( SI Приложение , рис. S9 A ). Перед загрузкой CD34 ⁺ eN подвергали воздействию блеомицина (eN-Bleo) в качестве сильнодействующего препарата, вызывающего повреждение ДНК (39).Препарат изменил метаболизм чМСК (снижение активности на 30%) ( SI Приложение , рис. S9 B ), но не их жизнеспособность в системе ( SI Приложение , рис. S9 C ).

В то время как обе ниши демонстрировали одинаковое содержание HSPC, общее количество HSC было значительно выше в eN-Bleo ( SI Приложение , рис. S9 D и E ). Наблюдаемое увеличение было результатом более высокого содержания HSC в ECM eN-Bleo (рис. 7 A ), в то время как состав крови был идентичен в SN как eN, так и eN-Bleo ( SI Приложение , рис.S7 А ). Клетки, выделенные из соответствующих ниш ECM, показали существенное снижение процента покоящихся HSCs в eN-Bleo (8% против 20% в eN) (Fig. 7 B ). Интересно, что это было ограничено HSCs, и клеточный цикл популяций HSPC и MPP не был затронут.

Рис. 7.

Возмущение поведения ГСК при моделировании повреждения в инженерной нише. ( A ) Сконструированные ниши, подвергшиеся воздействию блеомицина (eN-Bleo), показали большее количество HSC и MPP в ECM.Напротив, повреждение блеомицином не влияло на состав крови SN. n ≥ 3. ( B ) Поврежденные ниши (eN-Bleo) продемонстрировали нарушенную способность поддерживать HSC в состоянии покоя, что оценивалось с помощью анализа клеточного цикла. n ≥ 3. ГСК, гемопоэтические стволовые клетки; HSPCs, гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники; MLP, мультилимфоидные предшественники; MPPs, мультипотентные предшественники. ** Р < 0,01.

Эти данные показывают, что воздействие блеомицина ухудшает способность hMSC поддерживать HSC в состоянии покоя, что приводит к их повышенной пролиферации.Таким образом, мы подтверждаем возможность использования нашей системы для изучения кроветворения человека в определенных сценариях, например, после травмы.

Обсуждение

Мы сообщаем об успешной инженерии in vitro BM-подобных тканей в системе перфузионного биореактора. Созданные ниши демонстрируют высокую биологическую сложность, захватывая структурные, композиционные и организационные особенности нативной остеобластической среды человека, что приводит к поддержке функций HSPC. Кроме того, с помощью проверенной молекулярной настройки 3D-ниши и разработки конкретных сценариев травм система была проверена как инженерная платформа BM с настраиваемыми свойствами.

Тканевая инженерия открывает новые возможности для исследования стволовых клеток, позволяя нам решать фундаментальные биологические вопросы, которые невозможно исследовать с помощью традиционных культуральных планшетов. Тем не менее, его применение для создания жизнеспособных сред BM in vitro остается сложной задачей из-за ограничений моделирования, связанных со сложностью ткани. Это включает в себя точно определенную пространственную организацию, клеточное разнообразие и комбинированную пролиферацию и поддержание функциональности кровяного компартмента.Поскольку существующие модели (14, 15) не повторяют все эти особенности без исключения использования животных (40), мы в качестве альтернативы предложили дизайн «органоподобной» ткани для поддержки развития и поддержания кроветворения.

Наша система предлагает ключевые преимущества по сравнению с существующими подходами. Во-первых, в отличие от синтетических материалов (41⇓-43), внеклеточный матрикс более точно воспроизводит нативную микросреду. Несмотря на существенные достижения в этой области, искусственные матрицы не могут воспроизвести распределение и разнообразие сигналов, существующих в естественном ВКМ, и не предлагают их подходящего и физиологического представления (44⇓–46).Более того, посредством генетических модификаций hMSC и их индивидуального профиля секретируемых факторов мы ввели понятие модульности, ранее достигнутое с помощью синтетических матриц (41⇓-43). Биологическая доставка определенных цитокинов клетками представляет собой непрерывный процесс, в отличие от экзогенного добавления в культуральную среду, потенциально связанного с проблемой стабильности во времени. Эта стратегия весьма актуальна при распространении на предполагаемые нишевые факторы для идентификации ключевых клеточных подмножеств/молекул, влияющих на поведение стволовых клеток (47).В этом отношении наличие разделения в нашей системе может быть использовано для решения конкретных вопросов. Они варьируются от возможности изучения хемоаттрактантных эффектов интересующих факторов до исследования механизмов, управляющих высвобождением стволовых клеток за пределы их ниши, и связанных с ними функциональных различий.

Несмотря на то, что наш подход основан на биологическом опыте, он не полностью отражает сложность своего аналога in vivo (9). Важными отсутствующими компонентами являются, например, сосудистые и нейронные сети, которые, как известно, являются регуляторами активности HSC (48⇓-50).Это требует изучения их интеграции в систему, хотя и требует создания условий культивирования, поддерживающих жизнеспособность нескольких типов клеток (51). Тем не менее, описанная модель достигла следующего шага в сложности, что иллюстрируется наблюдаемой самоорганизацией мезенхимальных и кровяных компартментов, что предполагает развитие прокси BM с органоидными чертами.

В отличие от микрожидкостных подходов, мы нацелились на разработку макромасштабных ниш, чтобы сочетать разумную пропускную способность и множественные показания.В то время как микрожидкостные платформы состоят из миниатюрных систем с высоким уровнем распараллеливания, ограниченный объем и количество ячеек сдерживают мультиплексный анализ. Вместо этого размер нашей системы был совместим с несколькими одновременными оценками, включая экспрессию генов, проточную цитометрию, визуализацию и необходимое определение in vivo функциональности стволовых клеток и клеток-предшественников.

Мы наблюдали в нашей системе значительное увеличение количества фенотипических HSC. Это было достигнуто в строгих условиях без ксеногенов, включая низкую концентрацию гемопоэтических цитокинов, и было подтверждено с использованием одного донора CB и нескольких первичных материалов hMSC.Тем не менее, функциональность HSC все еще нуждается в тщательной оценке с помощью анализа вторичной трансплантации и лимитирующих разведений, прежде чем заявлять о функциональной экспансии HSC. С этой целью разработка и оптимизация 3D-параметров могут быть приняты для проверки суспензионных культур золотого стандарта (52), которые в настоящее время требуют высоких уровней цитокинов (53, 54) и добавок агонистов (52). Некоторые из параметров, которые можно настраивать в культуральной платформе с трехмерной инженерией, включают типы нишевых клеток, их конкретную стадию дифференцировки, каркасный материал (например,например, структура/состав) или физические факторы, определяемые перфузионной системой (например, напряжение сдвига, уровни кислорода/гипоксии). Все они действуют согласованно с синергетическими и конкурирующими эффектами и могут быть использованы для модуляции судьбы стволовых клеток (55).

Наконец, наша система может быть адаптирована для воспроизведения патологических состояний (56). Использование hMSC и/или HSPC, полученных от пациентов, страдающих заболеваниями крови (например, лейкемией), может дать возможность смоделировать заболевание in vitro в полностью человеческих и идеально персонализированных условиях.Это может представлять собой мощный инструмент с широким спектром применений, от выявления факторов, нарушающих регуляцию ниши или функций крови, до скрининга лекарств для прогнозирования реакции конкретного пациента на определенные виды лечения.

Перспективное выделение некроветворных клеток ниши и их дифференциальные молекулярные взаимодействия с ГСК | Кровь

Чтобы изучить это явление более подробно, мы сосредоточились на эндотелиальных клетках и МСК, выбрав взаимодействия, которые включают лиганды с особенно высокой экспрессией в 1 из этих 2 типов нишевых клеток (рис. 6).Среди этих предсказанных клеточно-специфических взаимодействий верхней ниши мы обнаружили несколько ранее описанных, таких как CXCR4/CXCL12 (CXCR4/SDF1) и KIT/KITL (KIT/SCF), связанные с MSC, или NOTCh2/JAG1, CD44/Selectin E или Селектин L/селектин Е, связанный с эндотелиальными клетками. Кроме того, 2 нишевые клетки экспрессировали различные компоненты внеклеточного матрикса, которые могут взаимодействовать с одной и той же молекулой клеточной адгезии на HSPC, такие как коллаген (эндотелиальные клетки) и ламинин β1 (МСК), взаимодействующие с интегрином β1 (HSPC).Наш анализ также был информативен в отношении взаимодействий рецептор-лиганд, которые, как было показано, участвуют в гомеостазе HSPC, но для которых не был определен клеточный источник лиганда (например, Axl / Gas6 ⁴⁷ с GAS6, экспрессируемым с помощью МСК). Наконец, наши результаты указывают на роль антагонистов лигандов в регуляции HSPC. МСК экспрессируют высокие уровни как CXCL12, так и его антагониста CXCL14. Более того, наряду с экспрессией BMP4, BMP5 и BMP6, МСК также экспрессировали фоллистатин-1 ( Fstl-1 ), антагонист надсемейства трансформирующего фактора роста β, известный своим ингибированием лигандов BMP.Эти специфические для МСК лиганды были особенно сильно экспрессированы МСК, выделенными из костного мозга (дополнительная фигура 6), однако МСК костного мозга и кости также демонстрировали отчетливую экспрессию рецепторов (дополнительная таблица 4). В эндотелиальных клетках мы обнаружили высокую и специфическую экспрессию как Jag1 , лиганда Notch, так и Egfl7 , антагониста Notch3 . Таким образом, наш глобальный анализ молекулярных взаимодействий, специфичных для клеток-ниш, с HSPCs идентифицирует предполагаемые новые пары рецептор-лиганд между клетками-нишами и HSPC.Это также указывает на сложную сеть, в которой как положительные, так и отрицательные лигандные стимулы сбалансированы для поддержания функции HSC.

Ниша

Мы и другие показали, что провоспалительные цитокины, такие как IFNa, могут приводить к эффективной активации покоящихся HSC in vivo (Essers et al. , Nature , 2009). Напротив, в условиях культивирования in vitro IFNa оказывает ингибирующее действие на культивируемые HSC, приводя к блокированию пролиферации HSC даже в присутствии поддерживающего фидерного слоя.Эти данные указывают на роль ниши BM в индуцированной воспалением стимуляции HSC. Однако лежащий в основе этого молекулярный механизм плохо изучен. Поэтому мы сосредоточимся на выяснении роли ниши BM в активации HSCs, вызванной воспалительным стрессом. В BM HSCs окружены внеклеточным матриксом (ECM), соединяющим HSCs с другими структурами ниши, таким образом, являясь интересным кандидатом, облегчающим коммуникацию между HSCs и компонентами ниши при стрессе. Матрилины (Matns) составляют семейство адапторных белков ВКМ, которые соединяют различные компоненты ВКМ, образуя надмолекулярную структуру.Один из Matns, Matn4, сильно экспрессируется в HSC, и экспрессия антикоррелирует с увеличением пролиферативной активности от HSC к предшественникам. Анализ мышей, лишенных Matn4, не показал явных гематологических аномалий, таким образом, Matn4 не требуется для поддержания HSC и покоя в условиях гомеостаза.